逆轉錄聚合酶鏈反應 Reverse transcription polymerase chain reaction 核酸檢測 RT-PCR

逆轉錄聚合酶鏈反應 Reverse transcription polymerase chain reaction 核酸檢測 RT-PCR

逆轉錄聚合酶鏈式反應( RT-PCR ) 是一種實驗室技術,將RNA 逆轉錄爲DNA (在本文中稱爲互補 DNA或 cDNA)並使用聚合酶鏈式反應(PCR) 擴增特定的 DNA 靶標。它主要用於測量特定 RNA 的量。這是通過使用熒光監測擴增反應來實現的,這種技術稱爲實時 PCR或定量 PCR (qPCR)。聯合 RT-PCR 和 qPCR 通常用於基因表達分析在研究和臨牀環境中對病毒 RNA 進行定量分析。

RT-PCR 和 qPCR 之間的密切關聯導致將術語 qPCR 用於表示 RT-PCR 的轉喻。這種使用可能會令人困惑,因爲 RT-PCR 可以在沒有 qPCR 的情況下使用,例如用於實現分子克隆、測序或 RNA 的簡單檢測。相反,qPCR 可以在沒有 RT-PCR 的情況下使用,例如量化特定 DNA 片段 的拷貝數。

命名法

組合的 RT-PCR 和 qPCR 技術已被描述爲定量 RT-PCR 或實時 RT-PCR (有時甚至稱爲定量實時 RT-PCR ),已被各種縮寫爲qRT-PCR, RT-qPCR, RRT-PCR,和 rRT-PCR。爲避免混淆,本文將始終使用以下縮寫:

並非所有作者,尤其是早期作者,都使用此約定,讀者在訪問鏈接時應謹慎。RT-PCR 已用於指示實時 PCR (qPCR) 和逆轉錄 PCR (RT-PCR)。

自 1977 年推出以來,Northern 印跡已被廣泛用於 RNA 定量,儘管它存在以下缺點:(a) 耗時的技術,(b) 需要大量 RNA 進行檢測,以及 (c) 在低丰度的情況下定量不準確RNA 含量。 然而,自從Kary Mullis於 1983 年發明PCR以來,RT PCR 已取代 Northern 印跡成爲 RNA 檢測和定量的首選方法。

RT-PCR 已成爲檢測和/或比較 RNA 水平的基準技術,原因如下:(a) 它不需要 PCR 後處理,(b) 範圍廣泛(>10 7倍)的 RNA丰度可以測量,並且 (c) 它提供了對定性和定量數據的洞察。由於其簡單性、特異性和敏感性,RT-PCR 被用於廣泛的應用,從簡單的實驗(如葡萄酒中酵母細胞的定量)到更復雜的用作檢測傳染性病原體(如禽流感)的診斷工具 病毒和SARS-CoV-2。

在 RT-PCR 中,首先使用逆轉錄酶(RT)將RNA模板轉化爲互補 DNA (cDNA)。然後將 cDNA 用作使用 PCR 進行指數擴增的模板。使用 RT-PCR 檢測 RNA 轉錄物已經在以下重要方面徹底改變了基因表達的研究:

使用 RT-PCR對mRNA進行定量可以通過一步或兩步反應來實現。兩種方法之間的區別在於執行程序時使用的管數。兩步反應要求逆轉錄酶反應和 PCR 擴增在不同的試管中進行。兩步法的缺點是由於更頻繁的樣品處理而容易受到污染。 另一方面,從 cDNA 合成到 PCR 擴增的整個反應在一步法中發生在一個試管中。一步法被認爲通過在單一環境中包含所有酶促反應來最小化實驗變化。它消除了將勞動密集型且容易污染的 cDNA 產物移液到 PCR 反應的步驟。進一步使用耐受抑制劑的聚合酶、聚合酶增強劑和優化的一步 RT-PCR 條件,支持從未純化或粗樣品(例如全血和血清)中逆轉錄 RNA 。 然而,起始 RNA 模板在一步法中容易降解,當需要對同一樣本進行重複檢測時,不建議使用這種方法。此外,據報道,與兩步法相比,一步法的準確度較低。當使用SYBR Green等 DNA 結合染料時,它也是首選的分析方法,因爲只需改變熔解溫度即可消除引物二聚體。然而,一步法是直接在生物傳感中快速檢測目標 RNA 的一種相對方便的解決方案。[需要引用]

RT-PCR 產物的定量可大致分爲兩類:終點法和實時法。使用終點 RT-PCR 來測量少量樣本中的基因表達變化是首選,但實時 RT-PCR 已成爲驗證從陣列分析或基因表達獲得的定量結果的金標準方法全球範圍內的變化。

End-point RT-PCR

終點 RT-PCR 的測量方法需要通過使用熒光染料(如溴化乙錠)、 使用磷光成像儀對 PCR 產物進行P32標記、或通過閃爍計數來檢測基因表達水平。終點 RT-PCR 通常使用三種不同的方法實現:相對、競爭和比較。

Relative RT-PCR

RT-PCR 的相對定量涉及同時對內部對照與感興趣的基因進行共擴增。內部控制用於標準化樣品。一旦標準化,就可以直接比較多個 mRNA 樣本的相對轉錄本丰度。需要注意的一項預防措施是,必須選擇內部控制,使其不受實驗處理的影響。表達水平應在所有樣品中保持不變,並與感興趣的 mRNA 保持一致,以使結果準確且有意義。因爲通過比較目標和控制擴增的線性範圍來分析結果的量化,所以在開始分析之前考慮起始目標分子的濃度和它們的擴增率是至關重要的。

Competitive RT-PCR

競爭性 RT-PCR 技術用於絕對定量。它涉及使用合成的“競爭者”RNA,可以通過大小或序列的微小差異將其與目標 RNA 區分開來。爲了獲得準確的結果,合成 RNA 的設計在序列上相同但比目標 RNA 略短是很重要的。設計和合成後,將已知量的競爭 RNA 添加到實驗樣品中,並使用 RT-PCR 與靶標共同擴增。然後,生成競爭 RNA 的濃度曲線,並用於比較內源性轉錄物產生的 RT-PCR 信號,以確定樣品中存在的靶標的數量。

Comparative RT-PCR

比較 RT-PCR 與競爭 RT-PCR 的相似之處在於,靶 RNA 在單個反應中與不相關序列的內標競爭擴增試劑。反應完成後,將結果與外部標準曲線進行比較以確定目標 RNA 濃度。與相對和競爭性定量方法相比,比較 RT-PCR 被認爲是更方便使用的方法,因爲它不需要研究者進行初步實驗;在相對 RT-PCR 中,必須預先確定 mRNA 的指數擴增範圍,而在競爭性 RT-PCR 中,必須合成合成的競爭 RNA。

Real-time RT-PCR

在過去幾年中,新型熒光 DNA 標記技術的出現使 PCR 產物的實時分析和檢測成爲可能,從而導致實時 RT-PCR 廣泛用於基因表達分析。實時 RT-PCR 現在不僅是定量基因表達的首選方法,它還是從全球範圍內獲得陣列分析和基因表達結果的首選方法。目前,有四種不同的熒光 DNA 探針可用於 PCR 產物的實時 RT-PCR 檢測:SYBR Green、TaqMan、分子信標和蠍子探針. 所有這些探針都允許通過產生熒光信號來檢測 PCR 產物。雖然 SYBR Green 染料僅通過與溶液中的雙鏈 DNA 結合而發出熒光信號,但 TaqMan 探針、分子信標和蠍子的熒光產生依賴於染料分子的Förster 共振能量轉移 (FRET)耦合和寡核苷酸底物的猝滅劑部分。

SYBR Green

當 SYBR Green 與 PCR 產物的雙鏈 DNA 結合時,它會在激發時發光。熒光強度隨着 PCR 產物的積累而增加。該技術易於使用,因爲由於缺乏結合特異性,不需要設計探針。然而,由於染料不能區分雙鏈 DNA 與 PCR 產物和引物二聚體的雙鏈 DNA,因此高估目標濃度是一個常見問題。在絕對需要準確量化的情況下,必須進行進一步的分析以驗證結果。然而,在實時 RT-PCR 產物檢測方法中,SYBR Green 是最經濟且最易於使用的方法。

TaqMan probes

TaqMan 探針是一種寡核苷酸,其 5′ 端有一個熒光探針,3′ 端有一個淬滅劑。在 PCR 擴增過程中,這些探針將與位於擴增子中的目標序列雜交併且當聚合酶複製與 TaqMan 結合的模板時,由於聚合酶 5′-核酸酶的活性,它也會切割熒光探針。因爲猝滅分子和熒光探針之間的緊密接近通常會阻止通過 FRET 檢測到熒光,所以去偶合導致熒光強度的增加與探針切割循環的數量成正比。儘管精心設計的 TaqMan 探針可產生準確的實時 RT-PCR 結果,但當必須爲每個分析的 mRNA 靶標製作單獨的探針時,合成起來既昂貴又耗時。 此外,這些探針對光敏感,必須小心冷凍,以防止降解。

Molecular beacon probes

與 TaqMan 探針類似,分子信標也利用 FRET 檢測,熒光探針連接到寡核苷酸底物的 5′ 端,猝滅劑連接到寡核苷酸底物的 3′ 端。然而,儘管 TaqMan 熒光探針在擴增過程中被切割,但分子信標探針保持完整並在每個反應循環中重新結合到新的目標。當遊離在溶液中時,熒光探針和猝滅劑分子的緊密接近會阻止熒光通過 FRET。然而,當分子信標探針與目標雜交時,熒光染料和猝滅劑會分離,從而導致激發時的光發射。與 TaqMan 探針一樣,分子信標的合成成本很高,並且每個 RNA 靶標都需要單獨的探針。

Scorpion probes

蠍子探針與分子信標一樣,在未雜交狀態下不會有熒光活性,這也是因爲 5′ 端的熒光探針被寡核苷酸 3′ 端的部分淬滅。然而,對於 Scorpions,3′ 端還包含與 5′ 端引物延伸產物互補的序列。當 Scorpion 延伸與其在擴增子上的補體結合時,Scorpion 結構打開,防止 FRET,並能夠測量熒光信號。

Multiplex probes

TaqMan 探針、分子信標和蠍子允許在單個試管中同時測量 PCR 產物。這是可能的,因爲每種不同的熒光染料都可以與特定的發射光譜相關聯。多重探針的使用不僅在不影響測試效用的情況下節省時間和精力,而且在基因缺失分析、突變和多態性分析、定量分析和 RNA 檢測等廣泛的研究領域中的應用,使其成爲實驗室的寶貴技術。許多紀律。

通常採用兩種策略來量化實時 RT-PCR 獲得的結果;標準曲線法和比較閾值法。

通過逆轉錄聚合酶鏈式反應的指數擴增提供了一種高度靈敏的技術,其中可以檢測到非常低拷貝數的 RNA 分子。RT-PCR 廣泛用於遺傳疾病的診斷,半定量地用於確定細胞或組織內特定不同 RNA 分子的丰度,作爲基因表達的量度。

RT-PCR 常用於測量基因表達的研究方法中。例如,林等人。使用qRT-PCR測量酵母細胞中Gal基因的表達。首先,林等人。設計了一種懷疑參與調節 Gal 基因的蛋白質的突變。假設這種突變選擇性地消除了 Gal 表達。爲了證實這一點,使用 qRT-PCR 分析了含有這種突變的酵母細胞的基因表達水平。研究人員能夠最終確定這種調節蛋白的突變降低了 Gal 表達。 Northern印跡分析用於進一步研究RNA的基因表達。

RT-PCR 在將真核基因插入原核生物中也非常有用。因爲大多數真核基因都含有內含子,它們存在於基因組中,但不存在於成熟的 mRNA 中,因此從 RT-PCR 反應產生的 cDNA 是準確的(不考慮逆轉錄酶易出錯的性質)DNA 序列,轉錄後直接翻譯成蛋白質。當這些基因在原核細胞中爲了蛋白質生產或純化而表達時,直接從轉錄產生的 RNA 不需要進行剪接,因爲轉錄本只包含外顯子. (原核生物,如大腸桿菌,缺乏真核生物的mRNA剪接機制)。

RT-PCR 可用於診斷遺傳病,例如Lesch-Nyhan 綜合徵。這種遺傳病是由HPRT1基因故障引起的,臨牀上會導致致命的尿酸尿結石和類似痛風的症狀。 [需要澄清]分析懷孕母親和胎兒的 HPRT1 mRNA 表達水平將揭示母親是否是攜帶者,以及胎兒是否可能患上 Lesch-Nyhan 綜合徵。

科學家們正在研究如何在癌症檢測中使用 RT-PCR 來幫助改善預後,並監測對治療的反應。根據癌症的類型,循環腫瘤細胞會產生獨特的 mRNA 轉錄本。目標是確定哪些 mRNA 轉錄物可作爲特定癌細胞類型的最佳生物標誌物,然後用 RT-PCR 分析其表達水平。

RT-PCR 常用於研究基因組由 RNA 組成的病毒的基因組,如流感病毒 A、逆轉錄病毒如HIV和SARS-CoV-2。

儘管具有主要優點,但 RT-PCR 並非沒有缺點。由於難以保持線性,反轉錄互補 DNA (cDNA) 在多個 PCR 循環期間呈指數增長,導致終點定量不準確。爲了準確檢測和定量樣品中的 RNA 含量,使用基於熒光的修改開發了 qRT-PCR,以監測每個 PCR 循環期間的擴增產物。該技術的極端敏感性可能是一把雙刃劍,因爲即使是最輕微的 DNA 污染也會導致不良結果。消除假陽性結果的一種簡單方法是包含錨點或標籤, 到基因特異性引物的 5′ 區域。此外,由於存在多種變異來源,包括模板濃度和擴增效率,量化研究的規劃和設計在技術上可能具有挑戰性。在樣品中加入已知量的 RNA,加入一系列 RNA 稀釋液生成標準曲線,然後加入無模板拷貝樣品(無 cDNA)可用作對照。

RT-PCR可以通過一步RT-PCR方案或兩步RT-PCR方案進行。

一步法 RT-PCR

一步式 RT-PCR 使 mRNA 靶標(最多 6 kb)進行逆轉錄,然後在單個試管中進行 PCR 擴增。需要注意的是,使用完整、高質量的 RNA 和序列特異性引物將產生最佳結果。

一旦選擇了包含逆轉錄酶、Taq DNA 聚合酶和校對聚合酶的混合物的一步法 RT-PCR 試劑盒,並獲得了所有必要的材料和設備,就可以製備反應混合物。反應混合物包括 dNTP、引物、模板 RNA、必要的酶和緩衝溶液。每次反應將反應混合物添加到 PCR 管中,然後添加模板 RNA。然後將 PCR 管置於熱循環儀中開始循環。在第一個循環中,發生 cDNA 的合成。第二個循環是初始變性,其中逆轉錄酶失活。剩下的 40-50 個循環是擴增,包括變性、退火和延伸。擴增完成後,可以用凝膠電泳分析 RT-PCR 產物。

(PCR 應用手冊和生物工具)

兩步法 RT-PCR

顧名思義,兩步法 RT-PCR 分兩步進行。首先是逆轉錄,然後是 PCR。這種方法比一步法更靈敏。試劑盒也可用於兩步 RT-PCR。就像一步 PCR 一樣,只使用完整的高質量 RNA 以獲得最佳結果。兩步 PCR 的引物不必是序列特異性的。

第一步

首先在 PCR 管中混合模板 RNA、引物、dNTP 混合物和無核酸酶水。然後,將 RNase 抑制劑和逆轉錄酶添加到 PCR 管中。接下來,將 PCR 管放入熱循環儀中進行一個循環,其中會發生逆轉錄酶的退火、延伸和失活。最後,直接進行第二步,即 PCR 或將產物儲存在冰上,直到可以進行 PCR。

第二步

將包含緩衝液、dNTP 混合物、MgCl 2、Taq 聚合酶和無核酸酶水的預混液添加到每個 PCR 管中。然後將必要的底漆添加到管中。接下來,將 PCR 管放入熱循環儀中,進行 30 個擴增程序循環。這包括:變性、退火和伸長。RT-PCR的產物可以用凝膠電泳分析。

定量 RT-PCR 測定被認爲是測量樣品中特定 cDNA 靶標拷貝數的金標準,但它的標準化程度很低。因此,雖然有許多出版物使用該技術,但許多出版物提供的實驗細節不足,並使用不合適的數據分析得出不恰當的結論。由於任何定量 PCR 數據質量的固有可變性,審稿人不僅難以評估這些手稿,而且研究也變得無法複製。認識到實驗條件報告標準化的必要性,發佈定量實時 PCR 實驗的最低信息(MIQE,發音爲 mykee)指南已由國際學術科學家聯盟出版。MIQE 指南描述了評估定量 PCR實驗所需的最少信息,這些信息應要求出版以鼓勵更好的實驗實踐並確保定量 PCR 數據的相關性、準確性、正確解釋和可重複性。

除了報告指南,MIQE 強調需要標準化與定量 PCR 相關的命名法以避免混淆;例如,縮寫qPCR應用於定量實時 PCR,而RT-qPCR應用於逆轉錄-qPCR,用於標準化的基因應稱爲參考基因而不是管家基因。它還建議不應使用商業衍生的術語,如TaqMan 探針,而是稱爲水解探針. 此外,建議用量化循環(Cq)來描述用於量化的PCR循環,而不是閾值循環(Ct)、交叉點(Cp)和起飛點(TOP),它們指的是相同的值,但由不同的實時儀器製造商創造。

該指南由以下要素組成:1) 實驗設計,2) 樣品,3) 核酸提取,4) 逆轉錄,5) qPCR 目標信息,6) 寡核苷酸,7) 方案,8) 驗證,以及 9) 數據分析。每個元素中的特定項目帶有 E(基本)或 D(理想)標籤。標記爲 E 的那些被認爲是關鍵和必不可少的,而標記爲 D 的那些被認爲是外圍的,但對於最佳實踐很重要。

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